細(xì)胞簡(jiǎn)介：

產(chǎn)品名稱 兔胚胎成纖細(xì)胞

組織來(lái)源 胚胎組織

產(chǎn)品規(guī)格 5×10^5Cells/T25

細(xì)胞簡(jiǎn)介 兔胚胎成纖細(xì)胞（Rabbit Embryonic Fibroblasts, REFs）分離自胚胎組織，是從妊娠中期（通常為胚胎發(fā)育12.5-14.5天）的兔胚胎中分離獲得的成纖樣間質(zhì)細(xì)胞，屬于貼壁生長(zhǎng)的原代成纖細(xì)胞，具有典型的成纖細(xì)胞形態(tài)與生物學(xué)功能，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞生物學(xué)研究中常用的模式細(xì)胞之。般通過(guò)剔除胚胎的頭部、內(nèi)臟（如心臟、肝臟）及四肢，保留軀干部分，酶消化分離獲得，典型形態(tài)為長(zhǎng)梭形或不規(guī)則多邊形（生長(zhǎng)形態(tài)特性與成纖細(xì)胞相似），呈貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中易形成方向性排列，增殖能力較強(qiáng)（原代至P5代前增殖活躍，隨傳代次數(shù)增加逐漸出現(xiàn)衰老現(xiàn)象）；可分泌多種細(xì)胞因子（如白血病抑制因子LIF、成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF）、extracellularmatrix（ECM）成分（如膠原蛋白、纖連蛋白），為其他細(xì)胞生長(zhǎng)提供微環(huán)境支持，能產(chǎn)生抑制ES細(xì)胞自主分化和促進(jìn)ES細(xì)胞增殖的因子，故能有效地促進(jìn)ES細(xì)胞的增殖并持其未分化特性和多潛能性，且分泌效果優(yōu)于外源添加的些因子；表達(dá)成纖細(xì)胞特異性標(biāo)志物（如波形蛋白Vimentin），不表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物（如角蛋白Cytokeratin）；可用于干細(xì)胞培養(yǎng)支持，作為胚胎干細(xì)胞（ESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）的飼養(yǎng)層細(xì)胞，通過(guò)分泌LIF持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)與自我更新能力；體外研究模型，用于研究成纖細(xì)胞功能（如ECM合成、細(xì)胞遷移）、胚胎發(fā)育機(jī)制、纖化疾?。ㄈ绶卫w化、肝纖化）的病理過(guò)程，以及藥物對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的作用效果；細(xì)胞衰老研究，REFs隨傳代自然衰老的特性，可用于探索細(xì)胞衰老的分子機(jī)制（如端?？s短、氧化應(yīng)激影響）及抗衰老藥物篩選；支持其他細(xì)胞培養(yǎng)，制備REFs條件培養(yǎng)基（培養(yǎng)REFs的上清液），為難以培養(yǎng)的細(xì)胞（如生殖細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞）提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)因子，或作為3D細(xì)胞培養(yǎng)的支架細(xì)胞構(gòu)建類(lèi)器官模型。不同種屬的胚胎成纖細(xì)胞，在基礎(chǔ)形態(tài)、貼壁生長(zhǎng)特性、核心分泌功能及常規(guī)培養(yǎng)條件上高度致，但是存在種屬差異性，如細(xì)胞體積大小、分泌因子效果、對(duì)干細(xì)胞支持能力、可傳代次、藥物敏感性等等，般優(yōu)選大鼠胚胎成纖細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，需要依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)選擇適配。

方法簡(jiǎn)介 實(shí)驗(yàn)室分離的兔胚胎成纖細(xì)胞采用-膠原酶混合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10? cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)室分離的兔胚胎成纖細(xì)胞經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

產(chǎn)品信息：

培養(yǎng)信息：

自備試劑： 0.25% 、PBS 、培養(yǎng)基

培養(yǎng)基： 兔胚胎成纖細(xì)胞培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含F(xiàn)BS、bFGF、Insulin、Penicillin、Streptomycin等)

換液頻率： 每2-3天換液次

生長(zhǎng)特性： 貼壁

細(xì)胞形態(tài)： 成纖細(xì)胞樣

傳代比例： 1:2

傳代特性： 可傳5代左右；3代以內(nèi)狀態(tài)佳

消化液： 0.25%

凍存步驟：

凍存前準(zhǔn)備?

確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，密度達(dá)80%-90%?。

配制凍存液：推薦50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+10%DMSO?。

?細(xì)胞處理?

棄去培養(yǎng)上清，用PBS潤(rùn)洗1-2次?。

加入消化后，用含血清的培養(yǎng)基終止消化。

?凍存操作?

離心（1000RPM，3-4分鐘）后棄上清，用凍存液重懸細(xì)胞?。

分裝至凍存管（每管1mL，細(xì)胞數(shù)100-400萬(wàn)）?。

4℃靜置10分鐘，-20℃ 2小時(shí)，-80℃過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮?。

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操作實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 原代細(xì)胞分離

?組織獲取?：采用成年SD大鼠，快速取出海馬或脊髓組織，置于低溫人工腦脊液（0-4℃）中保存?。

?消化與離心?：使用木瓜蛋白酶消化組織，通過(guò)Optiprep不連續(xù)梯度離心，收集組織細(xì)胞密集帶?。

?細(xì)胞培養(yǎng)?：將細(xì)胞懸液接種于含B27添加劑和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF-2）的培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)?。

2. 細(xì)胞純化

?差速貼壁法?：通過(guò)搖床分離（200r/min去除小膠質(zhì)細(xì)胞，280r/min收集少突前體細(xì)胞）?。

?免疫磁珠分選?：利用NG2抗體標(biāo)記后通過(guò)磁珠分選，提高純度?。

3. 細(xì)胞傳代與凍存

?傳代?：使用含EDTA和DNase I的消化液處理細(xì)胞，按1:3比例傳代?。

?凍存?：將細(xì)胞重懸于凍存液（含10% DMSO和90%胎牛血清），程序降溫后保存于液氮中?。

4. 功能驗(yàn)證

?免疫熒光染色?：檢測(cè)NG2、GFAP等標(biāo)志物表達(dá)，確認(rèn)細(xì)胞純度?。

?電生理記錄?：通過(guò)膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞電特性（如鈉電流）。